ترشيح التدفق العرضي TFF مع الطرد المركزي الفائق لإعداد الحويصلات الصغيرة خارج الخلية بكفاءة
Aug 28, 2026| الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) هي حويصلات نانوية الحجم تفرزها الخلايا التي تحتوي على الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة ومكونات أخرى، وتلعب دورًا مهمًا في التواصل بين الخلايا. تشترك الحويصلات الصغيرة الموجودة خارج الخلية من نوع الإكسوسوم- في أوجه تشابه كبيرة مع الخلايا الأصلية. بالمقارنة مع الجسيمات النانوية الاصطناعية، فإنها تظهر معدلات إزالة مناعية أقل وسمية أقل للخلايا، مما يجعلها مرشحة واعدة باعتبارها جديدةمركبات توصيل الأدوية داخل الجسم الحي. يمكن لجميع أنواع الخلايا تقريبًا أن تفرز هذه الحويصلات، وتنتقل الأبحاث حول استخدامها كحاملات للأدوية تدريجيًا من المختبر إلى التطبيقات السريرية. لكن،يظل الإنتاج على نطاق واسع-عائقًا كبيرًا.
الطرق الحالية لعزل الحويصلة خارج الخلية
وتشمل أساليب عزل الحويصلة خارج الخلية الحاليةالطرد المركزي الفائق، والطرد المركزي بتدرج الكثافة، وكروماتوجرافيا استبعاد الحجم -(SEC)، وترسيب البولي إيثيلين جلايكول (PEG).
يوفر هطول الأمطار PEG إنتاجية عالية وعملية بسيطة، ولكنه يرتبط بتلوث كبير بالبروتينات غير المرغوب فيها. يمكن أن يوفر الطرد المركزي بتدرج الكثافة وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم-منتجات عالية النقاء-، إلا أن كفاءتها منخفضة نسبيًا وتستغرق العمليات وقتًا-. يُستخدم الطرد المركزي الفائق على نطاق واسع، لكن حجم معالجته محدود بقدرة الطرد المركزي، مما يجعل من الصعب توسيع نطاقه.
تطبيق ترشيح التدفق العرضي لفصل sEV
لقد تم بالفعل تطبيق ترشيح التدفق العرضي (TFF) على فصل الجسيمات النانوية مثل الجسيمات الشحمية وناقلات الفيروسة البطيئة. في TFF، تتدفق التغذية بشكل عرضي عبر سطح الغشاء، مما يساعد على تقليل تلوث الغشاء ويجعل العملية أسهل في التوسع.
منذ الحويصلات الصغيرة خارج الخلية تتراوح عموما من30-200 نانومترفي القطر، أكاسيت غشاء 0.45 ميكرومتريمكن تحديدها في نظام TFF لإزالة البروتينات والحويصلات الأكبر حجمًا، بينما أكاسيت غشاء 300 كيلو دالتونيمكن استخدامه لإزالة البروتينات ذات الوزن الجزيئي -الصغيرة وتركيز الحويصلات الصغيرة خارج الخلية الموجودة في وسط الاستزراع.
توصيف المواد الخام بعد فصل TFF
أظهر تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) أن أقطار الجسيمات تم توزيعها بشكل رئيسي ضمن نطاق0-250 نانومتر.
ومع ذلك، كشف المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) عن وجود كمية كبيرة من البروتين الملوث، في حين لم تتم ملاحظة أي حويصلات خارج الخلية. أشارت هذه النتائج إلى أن هناك حاجة إلى خطوة تنقية إضافية في اتجاه مجرى النهر لزيادة تنقية الحويصلات خارج الخلية.
توصيف تركيز TFF بعد الترشيح الفائق 100 كيلو دالتون
تمت معالجة تركيز TFF بشكل أكبر باستخدامأنبوب الترشيح الفائق 100 كيلو دالتون.
أظهرت NTA أن أقطار الجسيمات في المركزات التي تم الحصول عليها بعد جولتين من الترشيح الفائق ظلت بشكل رئيسي ضمن نطاق0-250 نانومتر. ومع ذلك، أدى إجراء الترشيح الفائق مرتين إلى انخفاض كبير في عدد الجزيئات التي تم الحصول عليها.
أظهر تحليل TEM أنه لم يتم ملاحظة أي هياكل تشبه الحويصلات في المرة الواحدة-أو المرتين-من تركيزات الترشيح الفائق، بينما بقيت كمية كبيرة من البروتين الملوث.
لذلك،لا يمكن استخدام الترشيح الفائق 100 كيلو دالتون بشكل فعال لتنقية وسط الاستزراع بعد تركيز TFF.
توصيف تركيز TFF المنقى بواسطة الطرد المركزي الفائق
أظهرت NTA أن أقطار الجسيمات للمنتجات النقية تم توزيعها بشكل رئيسي ضمن نطاق0-250 نانومتر.
والأهم من ذلك، أن TEM كشف بوضوح عن هياكل تشبه الحويصلات-عبر مجالات رؤية مختلفة. أظهرت هذه النتائج أنه بعد تركيز وسط الثقافة باستخدام TFF،يمكن استخدام الطرد المركزي الفائق لاحقًا لمزيد من فصل وتنقية الحويصلات خارج الخلية.
توصيف sEVs المعزولة من الخلايا الجذعية الوسيطة المكيفة باستخدام TFF مع الطرد المركزي الفائق
أظهرت NTA أن أقطار الجسيمات للمنتجات النقية تم توزيعها بشكل رئيسي ضمن نطاق0-250 نانومتر.
تمت ملاحظة الهياكل الشبيهة بالحويصلة- بواسطة TEM. أظهر تحليل اللطخة الغربية تعبيرًا إيجابيًا عن البروتينات المرتبطة بالحويصلة خارج الخلية-.CD9، CD63، وALIXفي الحويصلات خارج الخلية النقية.
وأكدت هذه النتائج أن الحويصلات الصغيرة المنقاة خارج الخلية تحتوي على إكسوسومات، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام هذه الطريقة أيضًا فيعزل واستخراج الإكسوسوم.
الاستنتاج: تم دمج TFF مع الطرد المركزي الفائق لإعداد sEV عالي الجودة
وأظهرت الدراسة ذلكتركيز TFF وحدهنتج عن ذلك منتج يحتوي على كمية كبيرة من البروتينات الملوثة، وبالتالي لم يكن كافيًا للحصول على حويصلات خارج الخلية مؤهلة.
وبالمثل، باستخدام أأنبوب الترشيح الفائق 100 كيلو دالتون للتنقية الثانويةلم تسفر بشكل فعال عن هياكل حويصلة سليمة.
من خلال الجمع بين تركيز TFF وتنقية الطرد المركزي الفائق اللاحقة، يمكن دمج مزايا كلا التقنيتين للحصول علىمنتجات الحويصلات الصغيرة خارج الخلية-عالية الجودة.
بالمقارنة مع الطرد المركزي الفائق التقليدي وحده، يمكن للعملية المدمجة أن تكون فعالةتقليل وقت المعالجة الإجمالي وتحسين كفاءة الفصل.
في سير العمل هذا،يتيح TFF الإثراء السريع للعينات ذات الحجم الكبير-.، ومعالجة القيود المفروضة على الطرد المركزي الفائق التقليدي في معالجة كميات كبيرة من العينات. يقوم الطرد المركزي الفائق بعد ذلك بإجراء تنقية عميقة لإزالة-شوائب البروتين المركزة مع المساعدة في الحفاظ على نقاء الحويصلات وسلامتها.
علاوة على ذلك، فإن العملية لا تتطلب إضافةكواشف الترسيب الكيميائي الخارجيةمما يساعد في الحفاظ على النشاط البيولوجي للحويصلات إلى أقصى حد ممكن.
ومن وجهة نظر الترجمة الصناعية، فإن هذه العملية لها أهمية كبيرةتوسيع نطاق-الإمكانيةوقد يساعد في مواجهة التحديات المرتبطة بالإنتاج على نطاق واسع-للحويصلات خارج الخليةتوصيل الأدوية والطب التجديدي وتطوير المنتجات ذات الصلة. كما أنه يوفر أيضًا أساسًا تجريبيًا متينًا لتحسين العمليات اللاحقة والتصنيع التجريبي على نطاق واسع.
مرجع
وانغ لينغ، لي مينجشي، شو شا، وآخرون.إنشاء طريقة لفصل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق ترشيح التدفق العرضي مع الطرد المركزي الفائق. المجلة الصينية للبيولوجيا، 2022، 35(9): 1096-1101. دوى: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.